种子特异性启动子是只有在植物种子成熟中、后期大量表达其下游基因，能够调控外源基因在种子中特异性表达，使所驱动基因在种子中专一性表达(王关林和方宏筠, 2002)，最大限度的减少对农作物其他代谢途径的影响、种子中含有丰富的碳水化合物、特别是淀粉、蛋白质及脂肪。因此，种子特异性启动子的研究和应用在定向改良农作物品质性状方面具有重要的理论和实际意义。

近年来粮食作物中已克隆的种子特异性启动子主要有：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶启动子(Quand Takaiwa, 2004)、油体蛋白启动子(Kohno-Murase et al.,  2006)、小麦淀粉粒结合淀粉合成酶启动子(Kluth et al., 2002)、油菜napin蛋白启动子(Zhang et al., 2002)、油酸去饱和酶基因启动子(Li et al., 2007)等。这些启动子在植物转基因研究应用中显现出了非常显著的效果。

大豆球蛋白是大豆贮藏蛋白的主要成分，在大豆种子发育过程中逐渐积累，真核生物数据库中显示，该基因启动子序列中有较多的种子特异性表达元件。本研究利用PCR技术，从大豆基因组DNA中分离到球蛋白基因启动子序列G1p，长度为686bp，将其与含有GUS报告基因的pCAMBIA1301构建，转化EHA105，分别侵染大豆各个组织进行瞬时表达，通过G1p启动子在各个组织中的GUS组织化学分析，研究G1p启动子的表达强度和表达特性，为进一步应用奠定基础。

1结果与分析

1.1 G1基因启动子片段的克隆

以大豆基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到G1基因启动子片段长为686bp(图1)，将扩增片段连接到pMD18-T中，酶切鉴定正确(图2)。

1.2 G1p启动子的生物信息学分析

利用在线软件Neural Network Promote Prediction对大豆启动子G1p进行生物信息学分析，序列中含有可能与转录起始频率有关(李杰等, 2006)的CAAT盒和RNA聚合酶Ⅱ的结合位点(Mena et al., 1998)的TATA盒，还含有多个典型的种子特异性表达元件(图3)，如：RYrepeat(存在单,双子叶植物种子特异表达基因启动子中(Moreno-Risueno et al., 2008))，E-box(参与三酰基甘油合成和常存在于植物种子特异性表达基因启动子(Kim et al., 2007)，SEF4motif (胚特异蛋白SEF4结合位点(Chung et al., 2008))和多个顺式作用元件CAAT(Wu et al., 2000)、TATAA(Chamberland et al., 1992)等。这些作用元件可能对G1p的启动作用有重要影响。

1.3 G1p启动子表达载体的构建

植物表达载体pCAMBIA1301含有CaMV35S-GUS融合系统，本研究将克隆的G1p启动子取代植物表达载体pCAMBIA1301的CaMV35S，构建表达载体pCAM-G1p(图4)，进行双酶切鉴定(图5)，获得了686bp大小的片段，表明G1p启动子已正确插入pCAMBIA1301中。表达载体pCAM-G1p构建完成。通过冻融法将质粒pCAM-G1p和pCAMBIA1-301转化根瘤农杆菌EHA105中，PCR鉴定(图6)，表明已转入农杆菌中，用于下一步农杆菌介导大豆。

1.4 GUS活性检测

1.4.1 GUS组织化学染色

GUS组织化学染色结果表明(图7)：无侵染的大豆各个组织几乎没有被染出颜色，侵染PCAMBIA-1301载体的大豆各个组织都被染出了蓝色，而侵染pCAM-G1p载体的大豆种子中被染成蓝色，其他组织和无侵染的大概相同，说明载体pCAM-G1p只能驱动GUS基因在大豆种子中表达，具有种子特异性。

1.4.2 GUS荧光定量分析

荧光分析表明(图8)：阴性对照的大豆各个组织中荧光表达量都比较低，侵染载体pCAM-G1p的大豆根、茎、叶中荧光表达量和阴性对照相差不多，而种子中的荧光表达量较阴性对照提高比较明显。结果表明：启动子G1p在大豆根、茎和叶中几乎没有启动GUS基因表达，在种子中能比较明显的启动GUS基因表达，是一个种子特异性启动子。

2讨论

从大豆基因组DNA中分离得到大豆种子特异性启动子G1p，长度为686bp，利用生物数据库对启动子G1p序列进行分析，G1p启动子具有多个重要的顺式作用元件和种子特异性元件，这些作用元件对该启动子的表达调控可能有很大影响，有必要对这些作用元件进行进一步分析。在基因工程的研究中，基因的表达是十分复杂的过程，启动子能够调控基因的表达。目前最常用的启动子是组成型启动子，组成型启动子具有强启动功能，但有很多缺点，不仅造成了资源的浪费，还有可能影响植物的正常生长，如基因的组成性表达会给植物带来很大负担，打破植物本身代谢的平衡，有事会产生RNAi干涉现象，严重时会造成植物死亡等(张春晓等, 2004)，相比之下组织特异性表达启动子能够使基因在特定组织中表达，特异性性启动子可以驱使基因在特定组织中表达，克服组成型启动子的弊端。

由于组织特异性启动子有无与伦比的优越性，因而近些年克隆了很多组织特异性启动子，也有不少应用与实践中，组织型启动子的应用具有重要意义。本试验将G1p启动子片段取代35S启动子，与GUS基因融合，成功构建了植物种子特异表达载体，转化农杆菌中，通过GUS基因在大豆各个组织中表达，GUS组织化学染色和荧光定量分析表证明其具有较强的种子特异性，为理论研究和实践操作提供了一个较有效的种子特异性启动子。

3材料和方法

3.1材料及试剂

所用大豆为“吉豆2号”为吉林大学植物科学学院植物种质资源与利用研究室保存，取4~5叶龄幼苗叶片提取总基因组DNA。

大肠杆菌DH5α、植物表达载体pCAMBIA1301、根瘤农杆菌EHA105由吉林大学植物科学学院植物种质资源与利用研究室保存。pMD-18T载体购自TaKaRa公司。

试剂和酶均购自TaKaRa，DNA回收试剂盒购于维特洁公司，DNA序列测定、PCR引物由北京六合华大基因科技股份有限公司完成，5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc)购自上海生工生物工程公司，4-MU和4-MUG购自Sigma公司，其它试剂均为进口或国产分析纯。

3.2 G1启动子的克隆和序列分析

采用改良的CTAB法，从大豆幼苗叶片中提取大豆基因组DNA，根据GenBank中大豆球蛋白G1基因的上游启动子序列，设计和合成引物序列：上游引物G1-上：5'-GGGAATTCTAGCCTAAGTACGTACTCAAAATGC-3' (EcoRⅠ)；下游引物G1-下：5'-GAACCATGGGGTGATGACTGATGAGTGTTTAAGG-3' (NcoⅠ)，划线部分为酶切位点。连入克隆载体pMD18-T中，进行酶切鉴定和测序，正确的重组克隆载体命名为pMD18-T-G1p。利用植物顺式元件数据库PLACE(plantcis-actingregulatoryDNAelements, http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/) (Higo et al., 1999)对G1p启动子进行生物信息学分析。

3.3 GUS瞬时表达载体的构建

测序正确的pMD18-T-G1p质粒经EcoRⅠ和NcoⅠ双酶切后插入到pCAMBIA1301相应位点上，得到G1p和GUS基因融合的表达载体pCAM-G1p。阳性对照为由CaMV35S启动GUS基因的质粒pCAMBIA1301。利用冻融法将上述两个表达载体转化根瘤农杆菌EHA105中，PCR鉴定。

3.4农杆菌介导的大豆各组织的转化

按照胡新文等(Hu et al., 2009)的方法，含有pCAM-G1p和pCAMBIA1301质粒的农杆菌EHA105分别侵染大豆根、茎、叶和种子，阴性对照为无侵染的大豆根、茎、叶和种子。

3.5 GUS活性检测

按照Jefferson (Jefferson,1987)选取大豆各个组织进行GUS组织化学染色和荧光定量分析，取出部分大豆组织加入GUS染色液，37℃温育过夜，75%乙醇脱色，观察染色情况。另一部分大豆各组织，在研钵中用液氮研磨成粉末，加入提取缓冲液，4℃离心，上清液为GUS蛋白粗提液。取出部分加GUS反应底物4-MUG，进行荧光活性测定，进行三次重复，计算GUS活性值。

参考文献

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